一抗孵育。开启孵育器，将孵育器的顶盖取下，底板平放，相应调整胶垫部位处在中间位置，并且用封闭液将胶垫表层湿润；将封闭完成的一整张膜（膜外形尺寸应当低于胶垫外形尺寸），轻轻地铺平在胶垫上边，从一边轻轻地赶跑胶垫与膜相互之间的气泡。
将孵育器的顶盖轻轻地压向膜上，将长方形液槽一边与膜触及，膜上彩色Marker条带放置相应槽正中间部位，匀称扭紧四角紧固螺丝（紧固到液孔槽添加液体不排出或是流串到其他液孔槽为佳），液孔槽与膜间产生空腔液槽小室；将相应抗体工作液各自经过相应液槽背面随机一端的注液孔轻轻地加入液槽小室，抗体工作液通常的加入量不得超过液槽小室总容积的3/4；抗体工作液加入以后可把整个孵育器平放到摇床震荡孵育（振幅不能太强），还可以平放到适宜的温度静置孵育；孵育结束后，将孵育器向任意注液孔侧倾斜，将抗体工作液倒出，吸尽孔缘残留抗体工作液；从另一侧注液孔各自添加清洗液，尽量加满（切记不能串孔），浸泡3-5分钟依照步骤倾倒抗体工作液的办法倾倒清洗液；二抗孵育。假如一整张膜所采用的二抗一样，这时可将孵育器拆卸取下一整张膜在孵育盒内进行二抗孵育。倾倒掉清洗液，并吸走孔缘残余液，经过注液孔各自加入相应二抗。底物显色。松开紧固螺丝，取下顶盖，拆卸孵育器，取下一整张膜放到清洗液里洗涤3次；膜平放到干净显色板上，添加底物曝光或者通过化学发光仪拍照记录图片。